L'imagerie par microscopie optique à fluorescence est un domaine en pleine expansion et est devenue une méthode incontournable pour la recherche en biologie. En effet, des avancées technologiques récentes ont permis le développement de microscopes plus rapides et de meilleure résolution permettant de collecter des images tridimensionnelles d'un échantillon biologique vivant. Parallèlement, des progrès importants ont été réalisés dans le développement de sondes fluorescentes stables et lumineuses ce qui a révolutionné la capacité à suivre individuellement certaines cellules in vivo.
Le microscope confocal est un dispositif particulier de microscope photonique qui permet de localiser des molécules spécifiques, dans le contexte cellulaire, et apporte d'importantes contributions à l'étude fonctionnelle des systèmes biologiques à différents niveaux d'organisation : sub-cellulaire, cellulaire, tissulaire ou embryonnaire. Grâce à sa très faible profondeur de champs (environ 400 nm) cette technique permet de sectionner un échantillon en tranche optique de très bonne qualité sans traitement ultérieur. L'utilisation de traceurs fluorescents très spécifiques permet de localiser in situ avec une résolution spatiale de l'ordre quelques centaines de nanomètres, des composants macro-moléculaires tels que : acides nucléiques, protéines, mais également des petites molécules telles que des peptides, lipides, et même des ions.
Statif : le système est installé sur un microscope inversé DMI6000 entièrement motorisé et piloté par informatique
Objectifs : - 10x / 0,30 HCX PL FLUOTAR Dry (11506505) - Dist. de travail : 11,0mm – Champ maximal : 1550x1550μm (confocal) - 20x / 0,70 PL APO Multi-imm (oil-glyc-coveg:0,17-w(water salted)-0(water)(11506514) – Dist. de travail : 0,17mm → 0,26mm - Champ maximal : 775x775μm (confocal) - 40x / 1,25-0,75 HCX PL APO Oil (11506253) - Dist. de travail : 0,1mm – Champ maximal : 387,5x387,5μm (confocal) - 63x /1,40-0,60 HCX PL APO Oil (11506192) – Dist. de travail : 0,1mm – Champ maximal : 246x246μm (confocal) - 100x /1,40 HCX PL APO Oil (11506038) – Dist. de travail : 0,09mm – Champ maximal : 155x155μm (confocal)
Condenseur Modèle S28 - ouverture numérique de 0,55 avec une distance de travail minimale de 28mm.
Excitation de fluorescence : assurée par une source Leica EL 6000 de lumière fibrée (pas d'alignement nécessaire - pas d'échauffement de la préparation - durée de vie >2000h) avec 5 niveaux d'atténuation mécaniques : 0, 12,5, 25, 50 et 100%.
Domaines spectraux d'observation (non confcale) : - cube filtre A (exc. 340-380/ dichr. 400 / émission LP 425) pour le Dapi ou le Hoechst. - cube filtre I3 (exc. 450-490/ dichr. 510 / émission LP 515) pour la FITC, l'Alexa 488, l'eGFP, etc. - cube filtre N2.1 (exc. 515-560/ dichr. 580 / émission LP 590) pour la TRITC, la Cyanine 3, les Alexa 546, 555 et 568, etc.
Platine composée : - d’une platine motorisée XY permettant d'acquérir une mosaïque d'images afin de reconstituer une vue élargie des échantillons, ou d’imager différentes positions d'un échantillon avec la possibilité de se repositionner sur ces points au cours d'un time-lapse. - d’une sur-platine garantissant des déplacements rapides et un positionnement en Z (Z-galvo) précis (précision de 40 nm sur une épaisseur de 1.5 mm). Cette sur-platine peut être équipée de différents portoirs : pour lame, boite de pétri, plaque à puits et chambre de culture (pour l'installation de ces portoirs faire appel au responsable).
Enceinte thermostatée : l'ensemble du statif est placé dans une enceinte avec régulation de température et circulation de CO2.
Le système confocal
Sources d'excitation laser : - diode 405 nm (<7mW dans le plan focal) - laser Argon 458, 476, 488, 496, 514 nm (<50mW dans le plan focal) - diode DPSS 561nm (<12mW dans le plan focal) - laser He/Ne 633nm (<5mW dans le plan focal) Les intensités d'excitation sont contrôlées par une système AOTF.
Emission de fluorescence : en remplacement de filtres dichroïques, un dispositif AOBS (Acousto Optical Beam Splitter) sélectionne le cut-off d'émission avec un gain de rapidité, une absence de distorsions optiques et une grande souplesse spectrale. La lumière est ensuite dirigée sur un prisme qui permet de sélectionner très finement les gammes de longueurs d'onde imagées (entre 400 et 800 nm) sur 4 détecteurs PMT. Ce dispositif permet également de recueillir les spectres d'émission pour chaque voxel.
1 canal en transmission (Brightfield, DIC)
Scanner conventionnel vitesses d'acquisition : 10Hz =10 lignes par seconde) – 100Hz – 200Hz – 400Hz (défaut – zoom min 1) – 700Hz (zoom min 2,5) – 1000Hz (zoom min 2,5) - jusqu'à 1400Hz (zoom min 6)
- d'un statif inversé Zeiss équipé d'une chambre thermostatée et régulée en CO2 - d'une platine motorisée XY - d'un piezo électrique Z - couplé à un système d'épifluorescence (dapi, 488, 546) - d'une caméra Coolsnap HQ (Roper Scientific) - du logiciel d'acquisition Metamorph (Roper Scientific)
Fluorochromes
Base spectrale des fluorochromes organiques
(P. Leclerc compil. 03-02-15)
Avant de choisir un fluorochrome il faut impérativement savoir sur quel(s) instrument(s) sera étudié le signal de fluorescence afin de déterminer quelles en sont les possibilités spectrales en terme d'excitation et d'émission. Avec le microscope confocal SP5-AOBS, vous disposez des raies d'excitation laser : 405, 458, 476, 488, 496, 514, 561 et 633nm. Le système AOBS va permettre d'envoyer la lumière de la longueur d'onde d'excitation choisie vers l'objet et de récupérer toute la fluorescence émise par l'échantillon sur le prisme de diffraction. Le positionnement des fentes de détection devant les différents détecteurs permet de sélectionner volonté la bande spectrale d'émission dans laquelle on désire réaliser une image. Ainsi le choix des fluorochromes est principalement déterminé par la longueur d'onde d'excitation, et, dans le cas où plusieurs marqueurs sont combinés, par des longueurs d'ondes d'émission suffisamment espacées pour éviter les risques de crosstalk.
Les autres critères à prendre en compte sont:
- le coefficient d’extinction molaireε (on parle aussi d’absorbance molaire) qui est un paramètre d'absorption découlant directement de la loi de Beer- Lambert et qui exprime la variation d'intensité lumineuse (D.O.) en fonction de la concentration molaire de la molécule absorbante et de la longueur du trajet optique.
- le rendement quantiqueΦf(QE : quantum efficiency ou quantum yield) qui est égal au rapport entre le nombre de photons émis et le nombre de photons reçus dans la zone spectrale d’excitation du fluorochrome. Sa valeur varie donc entre 0 et 1. Ainsi un fluorochrome trés efficace va émettre beaucoup de photons de fluorescence par rapport au nombre de photons d'excitation qu'il aura reçu.
- le produit des 2 valeurs précédentes ε.Φf qui va déterminer la brillance du fluorochrome.
- la stabilité temporelle de la brillance du fluorochrome lorsqu'il est soumis a une excitation prolongée. Tous les fluorochromes organiques perdent de la brillance lorsqu'ils sont excités. C'est le phènomène du photoblanchiment (photo-bleaching ou bleaching). Trés dépendant des conditions du milieu : pH , présence de radicaux libres, etc, ce n'est que l'expérience qui permet d'appréhender plus ou moins bien ce paramètre. On peut partiellement atténuer ce phénomène en utilisant des milieux de montages anti-blanchiment mais, là encore, c'est l'expérience qui permettra de déterminer les bonnes conditions.
La liste qui suit n'est pas exhaustive mais elle offre quand même un choix assez complet.
Prestations / Tarifs
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